基因編輯器CRISPR的產生和發展

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  最先提出使用工具的人Michael Wiles

  2013年年初,Michael Wiles同美國緬因州傑克遜實驗室的高層管理者坐在一起,並且告訴了他們一種擁有驚人威力的DNA剪切新方法。

  這家簡稱為JAX的實驗室利用基因工程技術改造以JAXR Mice為注冊商標的小鼠,並將其出售給研究人員。

  它喜歡這樣自誇:這“是全世界質量最好和發表次數最多的小鼠模型”。

  Wiles為該實驗室評估和研發新技術。他相信,這個由細菌和古生菌用於保護自身免受病毒侵襲的免疫策略巧妙改編而來的新工具將使JAX改造小鼠的方式發生革命性變化。

  “在場的十幾個人中,有9個人睡著了。”Wiles表示,“當時沒人聽說過CRISPR。”

  Rudolf Jaenisch 在1974 年培育出首個轉基因小鼠,並且首次證明了CRISPR 在產生基因敲除小鼠方面的威力

  如今,絕大多數小鼠培育者都知道CRISPR。長久以來,JAX和其他培育新的小鼠品系的實驗室依賴於一個辛苦費力的多步驟過程,其中涉及利用基因工程技術改變小鼠的胚胎干細胞,將其注射進胚胎,並且培育若干代小鼠。

  即便是JAX最好的團隊,也需要用2年時間才能成功改造一隻小鼠。

  CRISPR利用一種可在受精卵上開展針對性基因手術的分子複合物替代了所有這一切。它能在6個月內產生一種被改造的小鼠。

  通過基因改造使基因被敲除或遺傳信息被添加進來的小鼠,成為從癌症、動脈粥樣硬化到阿爾茨海默氏症、骨關節炎、肌肉萎縮症和帕金森氏症等一系列人類疾病的關鍵研究模型。基因敲除和敲入小鼠還為研究特定基因的功能提供了一種強大的工具。

  “當你在以前培育基因敲除小鼠時,需要具備一些技能。”來自麻省理工學院的Rudolf Jaenisch表示,“現在,你不再需要這些技能。任何傻瓜都能做。”

  在科學界影響巨大

  CRISPR代表的是“成簇的、規律間隔的短回文重複序列”。

  它源自原核生物遺傳物質,並且是對後者的一種描述。CRISPR利用向導RNA將生物“剪刀”(通常是和CRISPR相關的蛋白——Cas9)傳送到基因組中的某個精確位置。一旦Cas9通過酶解進行了剪切,細胞便會嚐試愈合受傷的DNA。

  一種修複機製會導致基因敲除,而另一種會導致基因敲入。

  “CRISPR所做的全部事情是剪切DNA。”Wiles介紹說,“其他一些事情都是細胞修複系統完成的。這就是我們能搭便車的地方。”

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  說起基因編輯技術,目前最火的就是CRISPR/Cas9系統了,從科研工具到癌症治療,它的應用幾乎可以涵蓋生命科學的各個領域,不過它的應用主要是在分裂細胞中。

  最近,發表在《自然》期刊上的一篇文章闡述了Salk研究所(Salk Institute)研發的一種利用CRISPR/Cas9系統的創新型基因編輯技術,可以高效地對不分裂細胞進行基因編輯,為基因缺陷疾病治療打開了一扇全新的大門。

  位點特異性的基因整合一般是通過同源定向修複途徑(homology-directed repair, HDR),不過它在不分裂細胞中並不適用。

  在不分裂的細胞中(特別是哺乳動物),另一種雙聯斷裂修複機製——非同源末端連接途徑(non-homologous end joining, NHEJ)——更加活躍。為了對不分裂細胞進行基因編輯,Salk團隊決定從NHEJ途徑開始入手。

  HDR和NHEJ機製

  首先,Salk團隊利用CRISPR/Cas9系統對NHEJ機製進行優化,使DNA可以精確地插入到基因組的目標位置。

  研究者們創建了一個由核酸混合物組成的插入包,命名為“不依賴同源性的靶向整合”(homology-independent targeted integration, HITI)。

  然後,他們用失活的病毒將含有遺傳指令的HITI插入包遞送到由人胚胎干細胞分化來的神經元中,插入的基因成功地在神經元細胞中表達。

  接下來他們將同樣的HITI插入包遞送到成年小鼠大腦的視覺皮層,目標基因也成功地表達了。

  初步實驗的成功讓他們決定嚐試基因替換治療,測試這一技術是否可以在患了基因缺陷病——Mertk基因缺陷的視網膜色素變性——而導致失明的小鼠模型中起作用。

  這一次,他們將含有正常Mertk基因的HITI插件包遞送至3個禮拜大的小鼠眼睛中,在小鼠長到7-8個禮拜的時候,分析顯示患病小鼠對光線有反應,並且一系列的測試顯示小鼠的視力得到部分恢複。

  這一階段性的成果讓整個研究小組都很興奮,這說明將這一技術用於動物的基因缺陷修複是非常有希望的。

  Salk團隊的下一步計劃是如何提高HITI插入包的遞送效率。

  HITI技術的優勢在於它幾乎適合所有的靶向基因工程系統,所以隨著這些系統的安全性和效率不斷提高,HITI插入包的應用也會越來越廣。

  Salk研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte教授

  “我們現在可以利用這一技術對不分裂細胞進行基因編輯,來修複大腦、心髒和肝髒地基因缺陷基因。

  它讓我們第一次有能力去想象治療我們曾經無法治療的疾病,”文章通訊作者、Salk研究所的Juan Carlos Izpisua Belmonte教授說:“我們對這一技術的發現非常興奮,因為這是前所未有的。

  這是第一次我們可以對不分裂的細胞進行基因編輯,這項發現的應用將不可限量。

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  細胞的標準反應是試圖將斷點處的雙鏈DNA重新拚接起來。這通常需要吞噬掉或添加一些堿基,從而導致基因插入或刪除。實際上,這種修複努力會將一些小“排印錯誤”引入DNA文本,從而使基因喪失功能。

  Jaenisch首次證明了CRISPR在產生基因敲除小鼠方面的威力。

  在研究人員首次證實CRISPR在哺乳動物細胞中奏效的5個月後,Jaenisch和同事於2013年5月在《細胞》雜誌上發表了一篇論文。他們報告稱,該技術成功斷開了一組小鼠胚胎干細胞中的5個基因,而這在以前是不可能的。

  更重要的是,他們證實可完全繞過胚胎干細胞,並且同時敲除單細胞小鼠受精卵中的兩個基因。研究人員不再需要改造胚胎干細胞並不辭辛苦地培育若干代小鼠,以產生卵子或精子細胞中攜帶基因突變的小鼠。

  同時,研究人員若想培育擁有兩個突變的小鼠,也不再需要將單突變體雜交並經曆一個類似的耗時且煩瑣的流程,以獲得擁有被改變生殖細胞系的小鼠後代。

  自此以後,已有500餘篇論文詳細描述了CRISPR如何敲除以及敲入小鼠基因。

  “它產生的影響是巨大的。”在1974年培育出首個轉基因小鼠的Jaenisch表示。加拿大多倫多大學生物化學家Tak Mak則認為,此項技術真正改變了獲得這些被改造動物的時間和效率。據Mak估測,和利用胚胎干細胞相比,利用CRISPR改造小鼠的花費要便宜30%左右,從而使他的平均成本大大降低。

  革命性意義

  CRISPR的影響不能僅通過節省成本來衡量。此項技術的便利和速度使得在匆忙之中改造小鼠成為可能,從而解決了來自多倫多病童醫院的C. C. Hui最近面臨的特定問題:在基因敲除過程中,缺失基因未產生任何可觀察到的效應。Hui意識到,被敲除的基因同另一個可能對其作出補償的基因存在關聯。

  他向在多倫多表型基因組學中心監管小鼠培育的Lauryl Nutter求援。Nutter利用CRISPR使來自初始基因敲除過程的受精卵中的干擾基因發生突變。“我們獲得了受精卵,將CRISPR-Cas9注射進去。8周後,Hui便獲得了雙突變體。”

  Nutter介紹說,“如果利用胚胎干細胞,可能需要好幾年才能完成。”

  這場革命不只限於培育擁有生殖細胞系突變的小鼠。

  CRISPR還允許研究人員同時使若干疑似癌症基因在成年小鼠體細胞中發生突變。與此同時,CRISPR敲入可修正成年小鼠體內引發疾病的基因缺陷,比如導致血友病和鐮狀細胞性貧血的突變。

  若干研究小組計劃將CRISPR注射進正在發育的小鼠體內,目標則是創建可發揮條形碼作用的突變並且使科學家得以追蹤細胞分化時的細胞譜系。

  諸如多倫多表型基因組學中心、JAX等小鼠培育公司希望,CRISPR將極大地擴展它們產生的突變範圍。

  “現在,我可以獲得擁有3處基因改造的異乎尋常的小鼠,並能再次改造它。”Wiles介紹說,“我們無法利用胚胎干細胞進行連續的基因改造。我們可以將一隻擁有兩處基因改造的小鼠同另一隻擁有兩處基因改造的小鼠雜交,但獲得全部4處基因改造需要數年時間。”

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  任重而道遠

  不過,從某個方面來說,CRISPR革命步履蹣跚。在Jaenisch實驗室首次報告CRISPR的3個月後,他和同事在發表於《細胞》雜誌的第二篇論文中提出,CRISPR可輕易實施更加複雜的基因手術,即敲入DNA片段而非簡單地令基因喪失功能。

  作為示範,他們利用CRISPR將熒光標記敲入小鼠受精卵。

  當特定基因被開啟時,熒光標記便會亮起。

  研究人員還創建了對很多研究來說至關重要的條件突變體。

  約1/3的小鼠基因對於胚胎發育是必不可少的。如果這些基因從一開始就喪失功能,小鼠便不會誕生。

  因此,利用胚胎干細胞開展研究的科學家巧妙地設計出一種被稱為Cre-Lox 重組的系統。

  該系統僅在小鼠發育到足以在失去上述基因仍能存活下來後才會將基因敲除。這需要添加額外的DNA:位於靶基因兩側的Lox序列和一個Cre基因。其中,Cre基因可被啟動,以產生一種酶,用於修改Lox位點之間的DNA。

  Jaenisch團隊利用CRISPR將同一系統插入受精卵,並且報告稱以相對較高的效率培育出條件小鼠——約16%的受精卵產生了擁有正確突變的小鼠幼崽。

  雖然在英國惠康基金會桑格研究所領導一個團隊培育突變小鼠胚胎干細胞的William Skarnes是為Jaenisch的最初報告所折服的眾多研究人員之一,但當他試圖將該技術帶入自己的實驗室時卻感到了失望。“從他的論文看,這項技術很簡單。我非常有信心,它將淘汰掉胚胎干細胞。”

  Skarnes表示,“但令人失望的是,我們沒有人能重現Jaenisch所報告的效率。

  在JAX實驗室,產生擁有正確突變的小鼠幼崽的受精卵僅占1%或2%。

  同時,很多項目正走向失敗。很明顯,它並未被證實為一種穩健的方法。”

  無論目前CRISPR看上去有何種缺點,Wiles強調說,它在改造小鼠方面的潛力不應當被忽視。“CRISPR能做的事情有很多,而我們才剛剛開始入門。”

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